最常用的5款陽(yáng)離子脂質(zhì)你了解多少？AVT給您提供詳細(xì)的陽(yáng)離子脂質(zhì)介紹,快來(lái)了解一下吧！

 自DNA重組技術(shù)誕生，以重組DNA技術(shù)為核心的現(xiàn)代生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)蓬勃發(fā)展，已有十多個(gè)基因工程藥物上市。以基因工程藥物為主的各種基因工程產(chǎn)品和細(xì)胞工程產(chǎn)品陸續(xù)商品化。在基因治療中，基因載體是外源基因得以進(jìn)入受體細(xì)胞的關(guān)鍵，其中，陽(yáng)離子脂質(zhì)體目前被認(rèn)為是靶向性好，副作用小，穩(wěn)定性好和轉(zhuǎn)染效率較高的理想載體。陽(yáng)離子脂質(zhì)體通常由一種陽(yáng)離子脂質(zhì)和中性輔助脂質(zhì)在適當(dāng)?shù)臈l件下復(fù)合而成，陽(yáng)離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染效率與陽(yáng)離子脂質(zhì)的組成密切相關(guān)。

 陽(yáng)離子脂質(zhì)分子在結(jié)構(gòu)上由三個(gè)部分組成：一個(gè)或多個(gè)陽(yáng)離子頭部（head）、連接鍵（linker bond）和疏水尾部（hydrophobic tail）。

 陽(yáng)離子脂質(zhì)的頭部大都包含胺類基團(tuán)（除脂質(zhì)含脒基外），從簡(jiǎn)單的氨基到被甲基或羥乙基團(tuán)取代的季銨鹽。陽(yáng)離子脂質(zhì)的極性頭起著脂質(zhì)體與DNA、脂質(zhì)體-DNA復(fù)合物與細(xì)胞膜或細(xì)胞內(nèi)其它組分相互結(jié)合的作用。在陽(yáng)離子膽固醇衍生物中，帶有叔胺基團(tuán)的陽(yáng)離子膽固醇化合物比季銨鹽化合物有更高的轉(zhuǎn)染活力，并且毒性小得多。帶有多價(jià)極性頭基團(tuán)或具有多個(gè)正電荷極性頭的陽(yáng)離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染效率較高，這可能是因?yàn)樗cDNA的結(jié)合較牢固，且更易實(shí)現(xiàn)內(nèi)涵體逃逸。

 連接鏈的長(zhǎng)度能影響陽(yáng)離子脂質(zhì)體與細(xì)胞膜的相互作用，從而影響轉(zhuǎn)染活力。一般來(lái)說(shuō)，帶有長(zhǎng)連接鏈的陽(yáng)離子脂質(zhì)體能顯著增強(qiáng)與細(xì)胞膜的相互作用，轉(zhuǎn)染效率高。

 連接鍵是類脂分子很重要的組成部分，它決定了陽(yáng)離子脂質(zhì)體的化學(xué)穩(wěn)定性和生物可降解性。醚鍵和C-N鍵的化學(xué)穩(wěn)定性較高，但不易被生物降解，一般不適用于體內(nèi)實(shí)驗(yàn)；含有酯鍵的陽(yáng)離子脂質(zhì)體較易被生物降解，細(xì)胞毒性小，但它們的化學(xué)穩(wěn)定性通常較差。通常采用的連接鍵是化學(xué)穩(wěn)定性較高、但又可以生物降解的酰胺鍵和氨甲酰鍵等。

 常見(jiàn)的陽(yáng)離子脂質(zhì)體的疏水尾部主要有脂肪烴鏈和膽固醇環(huán)。脂肪烴鏈的碳原子數(shù)通常為12至18個(gè)，以達(dá)到在生理溫度下為脂雙層提供足夠的流動(dòng)性，又能使脂雙層膜維持一定的剛性，以便為陽(yáng)離子脂質(zhì)體在體內(nèi)的脂質(zhì)融合創(chuàng)造條件。對(duì)以脂肪鏈為尾部的脂質(zhì)體，碳鏈加長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率降低，但在鏈內(nèi)引入不飽和鍵可提高效率。將膽固醇用作疏水尾部，效果常常優(yōu)于脂肪鏈，因?yàn)橛伤鼌⑴c形成的雙分子層結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定。

                               

Dlin-MC3-DMA

 2018年全球首個(gè)用于治療治療家族性淀粉樣多發(fā)性神經(jīng)病變的siRNA脂質(zhì)體產(chǎn)品Onpattro在美上市，成功打開(kāi)了沉默細(xì)胞基因藥物的大門(mén)。

 ▲Onpattro

 Onpattro中運(yùn)用的陽(yáng)離子脂質(zhì)材料DLin-MC3-DMA也開(kāi)始備受關(guān)注。在這之前，DLin-MC3-DMA在國(guó)內(nèi)市場(chǎng)仍是一片空白。AVT基于深耕磷脂、脂質(zhì)體、脂肪乳方向多年的資源和經(jīng)驗(yàn)，推出新產(chǎn)品DLin-MC3-DMA。為陽(yáng)離子脂質(zhì)材料提供了一種“低毒高效”選擇。

 ▲ Onpattro中各組分的具體用量

 DLin-MC3-DMA作為新型陽(yáng)離子脂質(zhì)——可電離化陽(yáng)離子脂質(zhì)的代表，具有“低毒高效”的優(yōu)勢(shì)，它的化學(xué)名為4-(N,N-二甲基氨基)丁酸 (6Z,9Z,28Z,31Z)-庚三十碳-6,9,28,31-四稀-19-基脂，分子式C₄₃H₇₉NO₂，是一種無(wú)色至淡黃色的油狀液體，pKa=6.44。

 ▲DLin-MC3-DMA結(jié)構(gòu)式

 DLin-MC3-DMA具有獨(dú)特的pH依賴性電荷可變特性：酸性條件下呈正電性，而生理pH條件下呈電中性。它在Onpattro中的成功應(yīng)用，成為Alnylam對(duì)于siRNA遞送技術(shù)的關(guān)鍵，是制備肝臟靶向siRNA/LNP系統(tǒng)的“標(biāo)準(zhǔn)”脂質(zhì)材料。

 DLin-MC3-DMA產(chǎn)品信息

 1、產(chǎn)品名稱：DLin-MC3-DMA

 2、化學(xué)名稱：4-(N,N-二甲基氨基)丁酸（二亞油基）甲酯

 (6Z,9Z,28Z,31Z)-heptatriacont-6,9,28,31-tetraene-19-yl4-(dimethylamino)butanoate

 3、分子式：C₄₃H₇₉NO₂

 4、生產(chǎn)商：艾偉拓（上海）醫(yī)藥科技有限公司

 5、CAS號(hào)：1224606-06-7

 6、用途：陽(yáng)離子脂質(zhì)體      

 7、性狀：無(wú)色至淡黃色油狀液體

 8、純度：≥98%

 9、溶解性：不溶于水，易溶于DMSO、甲醇、乙醇。

 10、分子量：642.09

 11、保存條件：-20℃

 12、注意事項(xiàng)：避免與強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、強(qiáng)氧化性物質(zhì)接觸

 DLin-MC3-DMA圖譜信息

                                   

DMG-PEG2000

 隨著新冠肺炎mRNA疫苗的火熱研制而被大家認(rèn)識(shí)的脂質(zhì)新材料DMG-PEG2000迅速躥紅。許多小伙伴只知道DMG-PEG2000和DSPE-mPEG2000一樣具有長(zhǎng)循環(huán)作用且基因轉(zhuǎn)染效果更好，卻并不了解背后的具體原理。本期小編就給大家簡(jiǎn)單講解一下這類以DMG-PEG2000為代表的新型PEG化脂質(zhì)的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)。

 DMG-PEG2000英文全名1,2-dimyristoyl-rac-glycero-3-methoxypolyethylene glycol-2000，中文名可對(duì)應(yīng)翻譯為二肉豆蔻酰甘油-聚乙二醇2000。它的分子式為C₁₂₂H₂₄₂O₅₀，分子量2509.2（平均值），代表結(jié)構(gòu)如下：

 從結(jié)構(gòu)式上就能看出，該材料是通過(guò)PEG化修飾了一種短鏈脂質(zhì)，C14比常見(jiàn)的DSPE-mPEG2000的C18鏈短得多，這樣最直接的結(jié)果就是脂質(zhì)“錨”嵌插入脂質(zhì)膜較“淺”，在體循環(huán)過(guò)程中較易脫落。而這一設(shè)計(jì)最大的優(yōu)勢(shì)是解決了“PEG-dilemma”。PEG-dilemma 主要有三點(diǎn)：

 1、 PEG鏈的空間位阻作用屏蔽脂質(zhì)體與細(xì)胞膜間的相互作用，抑制靶細(xì)胞對(duì)脂質(zhì)體的攝??；

 2、 屏蔽脂質(zhì)體與內(nèi)涵體膜間的相互作用，妨礙 “內(nèi)涵體逃逸”，導(dǎo)致 RNA被降解無(wú)法順利進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)；

 3、 多次注射 PEG 化脂質(zhì)體誘發(fā)免疫反應(yīng)，引起加速血液清除（ABC）現(xiàn)象。一般的解決辦法有：降低脂質(zhì)體表面 PEG 的密度；使用可斷裂的 PEG-脂質(zhì)間linker，如酯鍵、腙鍵、肽鍵；使用短鏈脂質(zhì)，如采用C14脂質(zhì)錨定較C18更易于 PEG 從粒子表面解離。另外，DMG-PEG2000的短鏈（肉豆蔻酸，C14）比長(zhǎng)鏈（硬脂酸，C18）半衰期小可更快降解，DMG-PEG2000可降低脂質(zhì)體與細(xì)胞間的相互作用及吸附ApoE的能力，獲得最好的細(xì)胞基因沉默效果。

 “溶酶體/內(nèi)涵體逃逸”是RNA類藥物遞送的關(guān)鍵也是難點(diǎn)，藥效高低與其直接相關(guān)。使用含有短烷基鏈的聚乙二醇脂質(zhì)，可在實(shí)現(xiàn)體內(nèi)逃逸的同時(shí)快速解離，以此對(duì)抗PEG化造成的“內(nèi)涵體逃逸”失敗現(xiàn)象。這也是為何DSPE-mPEG2000在化藥脂質(zhì)體中常用而核酸類脂質(zhì)體藥物使用DMG-PEG2000的基因沉默/表達(dá)水平更高、藥效最好。

 DMG-PEG2000基本信息

 1、產(chǎn)品名稱：DMG-PEG2000

 2、化學(xué)名稱：1,2-二肉豆蔻酰-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇2000

 1,2-dimyristoyl-rac-glycero-3-methoxypolyethylene glycol-2000

 3、生產(chǎn)商：艾偉拓（上海）醫(yī)藥科技有限公司

 4、CAS號(hào)：160743-62-4

 5、分子式：C₃₂H₆₂O₅(C₂H₄O)n, n≈45

 6、用途：陽(yáng)離子脂質(zhì)體

 7、性狀：白色粉末

 8、溶解性：易溶于甲醇、氯仿，部分溶于水。

 9、分子量：約2509.2

 10、純度：≥98%

 11、保存條件：-20℃

 12、注意事項(xiàng)：避免與強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、強(qiáng)氧化性物質(zhì)接觸

 DMG-PEG2000圖譜信息

 ▼ H NMR

 ▼ C NMR

                                    

DOTAP及其安全性

 陽(yáng)離子脂質(zhì)體是基因治療中研究最多的一種載體，作為非病毒載體，其與病毒載體相比具有以下優(yōu)勢(shì)：

 保護(hù)治療基因在體內(nèi)循環(huán)中不被降解。通過(guò)對(duì)脂質(zhì)體的表面基團(tuán)進(jìn)行特殊修飾后的陽(yáng)離子脂質(zhì)體能很好地包封DNA片段，促進(jìn)復(fù)合物與細(xì)胞膜的融合，增加DNA的攝取和表達(dá)；

 高效穿過(guò)細(xì)胞膜和核膜，轉(zhuǎn)染細(xì)胞，使其表達(dá)/沉默基因；

 如果適應(yīng)癥為癌癥，則能夠選擇性的吸附于帶負(fù)電荷的新生腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞上，抗癌效果更好。

 在陽(yáng)離子脂質(zhì)體的研究中使用最多的陽(yáng)離子脂質(zhì)就是DOTAP了。它是兩親分子，主要由三部分組成：極性頭部(親水基團(tuán))、連接鍵、疏水尾部。

 通過(guò)靜電作用與帶有負(fù)電荷的DNA分子相結(jié)合的是DOTAP的極性頭部，通常由叔胺或季銨鹽構(gòu)成，后來(lái)又研究出咪唑頭部、氨基酸頭部等。其極性頭部對(duì)核酸分子的包載效率以及細(xì)胞毒性均有重要的影響。處方中DOTAP用量越大載藥量越大，但zeta電位過(guò)高細(xì)胞毒性也越大，制劑安全性受影響，兩者需平衡。

 目前DOTAP較為成功的應(yīng)用案例有紫杉醇陽(yáng)離子脂質(zhì)體EndoTAG-1以及喜樹(shù)堿藥物的陽(yáng)離子脂質(zhì)體EndoTAG-2，其作為優(yōu)秀的轉(zhuǎn)染試劑應(yīng)用也很廣泛。

DOTMA

 DOTMA作為一種性能優(yōu)秀的陽(yáng)離子脂質(zhì)材料被廣泛應(yīng)用于非病毒基因轉(zhuǎn)染，如Invitrogen的轉(zhuǎn)染試劑Lipofectin。相較于DOTAP、DC-CHOL、DODMA等，它在擁有更高轉(zhuǎn)染效率的同時(shí)細(xì)胞毒性也更小，因此在藥用陽(yáng)離子脂質(zhì)體開(kāi)發(fā)中的研究也越來(lái)越多。

 DOTMA分子結(jié)構(gòu)上具有“較大尾扇，較小頭部”的特性，在脂質(zhì)體微觀形態(tài)、體內(nèi)穩(wěn)定性以及與細(xì)胞膜相作用等方面較DC-CHOL、DEPC等更好。DOTAP也具有類似的結(jié)構(gòu)性質(zhì)，但DOTAP對(duì)DNA/RNA的包載效率不如DOTMA，在同等藥效下DOTAP劑量要比DOTMA高得多，隨之而來(lái)的細(xì)胞毒性也就更大，安全性不如DOTMA。RNA脂質(zhì)體的效果與其所用陽(yáng)離子脂質(zhì)的飽和度（雙鍵數(shù)量）、側(cè)鏈長(zhǎng)度、頭部基團(tuán)、N價(jià)態(tài)等因素密切相關(guān)，DOTMA正是綜合了這幾方面的優(yōu)勢(shì)，因此具有很好的應(yīng)用特性。一般處方設(shè)計(jì)時(shí)與膽固醇、PC類磷脂和PEG化脂質(zhì)合用。

 圖表引用自：R Kola?inac, C Kleusch. Deciphering the Functional Composition of Fusogenic Liposomes. Int. J. Mol. Sci. 2018, 19(2), 346.

 DOTMA其它應(yīng)用優(yōu)缺點(diǎn)整理

 優(yōu)點(diǎn)

 對(duì)核酸包載效率高，RNA/DOTMA脂質(zhì)復(fù)合物中RNA包封率可達(dá)100%；

 基因轉(zhuǎn)染效率高，某些細(xì)胞上能高出DOTAP處方10倍多；

 細(xì)胞毒性較小，安全性好；

 可GMP大規(guī)模生產(chǎn)。

 缺點(diǎn)

 價(jià)格較高；

 轉(zhuǎn)染效率不如DLin-MC3-DMA等可電離陽(yáng)離子脂質(zhì)；

 目前仍處于實(shí)驗(yàn)室研究階段，沒(méi)有上臨床的產(chǎn)品。

DOPE為何經(jīng)常出現(xiàn)在陽(yáng)離子脂質(zhì)處方中

   陽(yáng)離子脂質(zhì)體可與大分子DNA形成復(fù)合物，極大壓縮DNA分子體積，從而有效進(jìn)入細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，又能避免病毒載體可能帶給病人的免疫毒性，因此是安全有效的基因治療載體。DOTAP（溴化三甲基-2, 3-二油酰氧基丙基銨）、DOTMA（氯化三甲基-2, 3-二油烯氧基丙基銨）、DC-Chol（3β-[N-（N’，N’-二甲基胺乙基）胺基甲?；鵠膽固醇）是較為常用的陽(yáng)離子脂質(zhì)，但單獨(dú)形成脂質(zhì)體穩(wěn)定性、膜融合性、轉(zhuǎn)染效率差，所以常需要添加輔助脂質(zhì)。其中DOPE（二油酰磷脂酰乙醇胺）是最為常用的輔助脂質(zhì)，比使用DOPC（二油酰磷脂酰膽堿）、CHO（膽固醇）脂質(zhì)體的融合性、轉(zhuǎn)染效率均高。

 一般來(lái)說(shuō)，正常的陽(yáng)離子脂質(zhì)體處方中需含有陽(yáng)離子脂質(zhì)、膽固醇、中性助磷脂以及PEG化磷脂，各種脂質(zhì)成分的選擇經(jīng)常是因項(xiàng)目不同而各異，但在查閱文獻(xiàn)過(guò)程中大家都會(huì)發(fā)現(xiàn)一個(gè)共同點(diǎn)，那就是處方中常出現(xiàn)DOPE的身影，這是為什么呢？

 DOPE可說(shuō)是非常常用的助磷脂（helper lipid），在制備陽(yáng)離子脂質(zhì)體過(guò)程中具有很強(qiáng)的協(xié)同作用，主要原理如下：

 中性不穩(wěn)定助類脂：起穩(wěn)定雙層膜和降低陽(yáng)性成分毒性的作用。

 干擾類脂膜，使內(nèi)涵體膜不穩(wěn)定：在細(xì)胞內(nèi)能促進(jìn)DNA、RNA的釋放，同時(shí)輔助陽(yáng)離子脂質(zhì)體的細(xì)胞滲透。

 能夠確定核酸+脂質(zhì)體復(fù)合物的形態(tài)，可是脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)從多相Lα相躍遷到六角HII相，使復(fù)合物具有良好的可融性，能顯著提高跨膜效率。

 因此，DOPE的加入可使得陽(yáng)離子脂質(zhì)體膜融合更好、穩(wěn)定性更高、細(xì)胞毒性更小。大量研究表明類脂聚合物單獨(dú)作用時(shí)不能轉(zhuǎn)染細(xì)胞，而加入DOPE能解決這個(gè)問(wèn)題，比如使用DC-Chol/DOPE可表達(dá)CAT基因，而復(fù)合物DC-Chol/DOPC則沒(méi)有活性。

膽固醇CHO-HP

 CHO-HP為注射用脂質(zhì)體專用輔料，可增強(qiáng)脂質(zhì)體膜穩(wěn)定性，減少藥物滲漏，增強(qiáng)脂質(zhì)體囊泡抗擊外部條件變化的能力?；钚愿叩年?yáng)離子脂質(zhì)一般都含有2個(gè)以上雙鍵，體內(nèi)穩(wěn)定性較差因此需要較高的膽固醇用量。

 CHO-HP是在cGMP條件下生產(chǎn)的高純度注射級(jí)藥用輔料，DMF號(hào)：024780，藥用輔料登記號(hào)：F20170000106（A）。與國(guó)內(nèi)慣用的動(dòng)物組織提取法生產(chǎn)膽固醇不同，CHO-HP是以羊毛油脂為原料，采用半合成方法制得，純度高（>99%），且不會(huì)有動(dòng)物組織的病毒污染問(wèn)題，在國(guó)際上多個(gè)上市脂質(zhì)體產(chǎn)品中長(zhǎng)期應(yīng)用。

 CHO-HP為白色粉末狀固體，室溫下穩(wěn)定性較好，但對(duì)光敏感，因此應(yīng)該避光、封閉保存，保存得當(dāng)，有效期可達(dá)5年。本品在三氯甲烷中易溶（1g/4.5ml），在乙醚中溶解（1g/2.8ml），在丙酮、乙酸乙酯或石油醚中略溶，在乙醇中微溶，在水中不溶（0.2mg/100ml）。

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