本期艾偉拓給您分享RNA類藥物以及疫苗的研究進(jìn)展，針對(duì)病毒感染和多種腫瘤的RNA類疫苗也已經(jīng)進(jìn)入臨床前期和臨床試驗(yàn)階段，感興趣的小伙伴速來圍觀！

 以mRNA和RNA病毒為基礎(chǔ)研制的藥物和疫苗展現(xiàn)出巨大潛能并能在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)直接翻譯而減少染色體整合。但其應(yīng)用仍受RNA降解相關(guān)的轉(zhuǎn)運(yùn)及穩(wěn)定性問題的限制?；赗NA類藥物的臨床試驗(yàn)已經(jīng)在多個(gè)疾病領(lǐng)域展開。同時(shí)針對(duì)病毒感染和多種腫瘤的RNA類疫苗也已經(jīng)進(jìn)入臨床前期和臨床試驗(yàn)階段。RNA轉(zhuǎn)運(yùn)和穩(wěn)定性的提升，包括RNA結(jié)構(gòu)改造，靶向樹突狀細(xì)胞和自體擴(kuò)增RNA的應(yīng)用。單鏈RNA病毒包含自體擴(kuò)增RNA，使它可以在細(xì)胞質(zhì)中產(chǎn)生大量RNA復(fù)制體來支持RNA類藥物和疫苗的發(fā)展。盡管寡核苷酸類方法也展現(xiàn)了其潛力，但在這篇文章中我們主要關(guān)注以mRNA和RNA病毒為基礎(chǔ)的方法。

 藥物發(fā)展長(zhǎng)期以來被療效不佳，不良反應(yīng)和高昂費(fèi)用等問題困擾。因此，藥物研發(fā)的新方法一直很受重視。RNA為基礎(chǔ)的方法為研制靶向針對(duì)受累細(xì)胞的藥物和針對(duì)免疫反應(yīng)刺激細(xì)胞的疫苗提供了優(yōu)勢(shì)。臨床試驗(yàn)中，RNA藥物在治療眼部疾病，心血管疾病和多種腫瘤方面有所成效。同時(shí)，已經(jīng)證實(shí)在動(dòng)物模型中RNA疫苗對(duì)致死劑量的埃博拉病毒和腫瘤細(xì)胞有保護(hù)作用。

 背景介紹

 現(xiàn)代藥物研制因轉(zhuǎn)運(yùn)不充分，藥物療效和安全等問題而無法改進(jìn)或發(fā)明新藥。相比傳統(tǒng)制藥方法，小分子藥物和生物療法的發(fā)展以及將核酸的應(yīng)用有很大的發(fā)展?jié)摿Α＿@篇文章中，胞質(zhì)DNA和寡核苷酸類藥物也有所涉及。然而，近期技術(shù)發(fā)展為應(yīng)用RNA類藥物的研制創(chuàng)造了可能。直接方法包括將以在靶細(xì)胞內(nèi)迅速翻譯來表達(dá)有治療效果基因的療效或者生成可以用來制作疫苗的抗原為目的mRNA注入細(xì)胞。由于RNA序列的出現(xiàn)，轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄片段因被快速降解而只能得到非常有限的暫時(shí)轉(zhuǎn)錄表達(dá)并且削弱了療效。為提高RNA的穩(wěn)定性，我們付出了很大的努力。同樣，轉(zhuǎn)運(yùn)RNA的問題也備受關(guān)注，轉(zhuǎn)運(yùn)的方法包括：用磷脂分子、聚合物或者納米粒子來包裹RNA分子以及靶向樹突狀細(xì)胞（DCs）也就是抗原呈遞細(xì)胞。另一種方案中，以RNA病毒為基礎(chǔ)的自體擴(kuò)增RNA也應(yīng)用于RNA的轉(zhuǎn)運(yùn)。在這篇綜述中，將會(huì)介紹用于實(shí)現(xiàn)RNA穩(wěn)定性，轉(zhuǎn)運(yùn)和擴(kuò)增各種方法。并且也會(huì)討論到最新的RNA類藥物和疫苗的進(jìn)展。這篇綜述將會(huì)集中論述mRNA和RNA病毒類藥物和疫苗而不會(huì)涉及寡核苷酸類治療方法。

 一、RNA穩(wěn)定性的提升

 由于單鏈RNA(ssRNA)對(duì)降解的敏感性，我們?yōu)榱颂岣逺NA分子的穩(wěn)定性做了很多努力。包括將經(jīng)過證實(shí)具有穩(wěn)定mRNA分子和啟動(dòng)翻譯的序列進(jìn)行改造。并且化學(xué)改造核苷也可以增強(qiáng)對(duì)降解的抵抗。

 1、帽結(jié)構(gòu)

 5‘端7-甲基鳥苷三磷酸（m7G）的帽結(jié)構(gòu)對(duì)RNA穩(wěn)定性起到很關(guān)鍵的作用。盡管帽結(jié)構(gòu)已經(jīng)應(yīng)用于體外RNA轉(zhuǎn)錄，但因帽結(jié)構(gòu)反向匹配結(jié)合后導(dǎo)致不能有效的轉(zhuǎn)錄生成mRNAs依然是一個(gè)問題。用只有一個(gè)3’-OH群的抗反向帽結(jié)構(gòu)（ARCAs）來代替兩個(gè)3’-OH群的帽結(jié)構(gòu)就可以防止反向匹配結(jié)合的問題。與傳統(tǒng)帽結(jié)構(gòu)相比，應(yīng)用ARCAs使RNA 轉(zhuǎn)錄效率提高了兩倍以上。并且，有ARCAs帽結(jié)構(gòu)的體外轉(zhuǎn)錄RNA轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞后RNA表達(dá)蛋白質(zhì)的持續(xù)時(shí)間和水平都有明顯提高。由于無法到達(dá)100%的加帽率，轉(zhuǎn)錄后再加帽結(jié)構(gòu)的方法已經(jīng)被應(yīng)用來提高未加帽結(jié)構(gòu)RNA的翻譯效果。近期研究發(fā)現(xiàn)一些細(xì)菌RNA 片段在5’末端也有類似真核細(xì)胞RNA帽結(jié)構(gòu)的結(jié)構(gòu)。并且在革蘭陰性和革蘭陽性細(xì)菌中都發(fā)現(xiàn)了5’端的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）和3‘端的脫磷輔酶（dpCoA），我們假設(shè)脫氫NAD+(NADH)和dpCoA在RNA轉(zhuǎn)錄起始后像帽結(jié)構(gòu)一樣被加在RNA上的。然而，最新的研究表明在NAD+,NADH, dpCoA 是在RNA轉(zhuǎn)錄起始階段整合到RNA上的。它們被認(rèn)為是在細(xì)胞RNA多聚酶（RNAP）重新啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的非經(jīng)典核苷酸啟動(dòng)因子（NCINs）。并且細(xì)菌RNAP和真核細(xì)胞RNAPⅡ都整合了NCIN帽結(jié)構(gòu)。NCIN帽結(jié)構(gòu)的效率與DNA啟動(dòng)子上游及所處的轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)序列有關(guān)。而且NCIN帽結(jié)構(gòu)在體內(nèi)是功能序列。這些發(fā)現(xiàn)對(duì)未來更好的轉(zhuǎn)運(yùn)和表達(dá)RNA的穩(wěn)定性有很大的助益。

 2、Poly（A）尾

 另一種穩(wěn)定RNA分子的方法是在mRNAs3‘端加poly(A)尾。已經(jīng)證實(shí)poly(A) 尾和5‘端m7G帽結(jié)構(gòu)通過結(jié)合PABP起協(xié)同作用。PABP與真核細(xì)胞翻譯啟始因子eIF4G相互作用并和5’端m7G帽結(jié)構(gòu)、真核細(xì)胞翻譯啟始因子eIF4E共同構(gòu)成復(fù)合物。Poly（A）尾可以通過將含poly(A)尾基因的片段編輯在DNA模板上或利用重組poly（A）多聚酶在體外轉(zhuǎn)錄RNA完成轉(zhuǎn)錄后延長(zhǎng)生成這兩種方法加在mRNAs上。其中利用重組poly（A）多聚酶的方法缺點(diǎn)是生成的poly（A）尾的長(zhǎng)度不一。相比之下，利用DNA模板生成的poly（A）尾因具有一定的長(zhǎng)度從而成為最佳選擇。就poly（A）尾的構(gòu)建而言，已經(jīng)證實(shí)了增加poly（A）尾的長(zhǎng)度可以提高形成多聚體的效率同時(shí)也會(huì)影響蛋白質(zhì)表達(dá)的水平?；诙鄠€(gè)研究可以得出體外轉(zhuǎn)錄mRNAs最適宜poly（A）尾的長(zhǎng)度在120-150個(gè)核苷酸左右。

 3、5’和3’端非翻譯區(qū)

 非翻譯區(qū)（UTRs）對(duì)基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)起著非常重要的作用。它包括調(diào)節(jié)mRNA從核內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)和翻譯的效率，亞細(xì)胞定位和mRNA穩(wěn)定性。并且，非翻譯區(qū)，尤其是3‘端UTR的保守莖環(huán)結(jié)構(gòu)和硒代胱氨酸插入序列也與mRNA中硒代胱氨酸密碼子UGA翻譯成硒代胱氨酸有關(guān)。從5‘端和3‘端插入非翻譯序列就擁有了關(guān)鍵調(diào)節(jié)基團(tuán)便可以優(yōu)化體外mRNA的轉(zhuǎn)錄。alpha球蛋白3’端UTRs的整合經(jīng)證實(shí)確有穩(wěn)定mRNA的作用。況且5‘端和3’端的β球蛋白UTRs還可以提高翻譯效率。球蛋白UTRs已經(jīng)被應(yīng)用于優(yōu)化體外RNA轉(zhuǎn)錄包括RNA自體T細(xì)胞電穿孔技術(shù)和裸抗原編碼的RNA結(jié)內(nèi)注射技術(shù)。并且，被轉(zhuǎn)染了抗原表達(dá)UTRs優(yōu)化的RNA的樹突狀細(xì)胞（DCs）已經(jīng)被用來免疫CMV陽性的個(gè)體和腫瘤病人了。

 4、化學(xué)改造核苷

 為了提高RNA的治療效果，在RNA翻譯后整合天然核苷已經(jīng)在體外試驗(yàn)中證實(shí)可以有效地減少轉(zhuǎn)錄RNA引起的免疫反應(yīng)。例如，由假尿苷改造過的體外轉(zhuǎn)錄mRNA可以提高RNA的穩(wěn)定性和翻譯效率。盡管RNA可以通過激活Toll樣受體來刺激免疫系統(tǒng)，但是整合改造的核苷（甲基化或假尿苷）會(huì)降低其激活能力，最終導(dǎo)致樹突狀細(xì)胞（DCs）內(nèi)細(xì)胞因子的嚴(yán)重下降和生物標(biāo)記物低活性。因此這種方法會(huì)導(dǎo)致TLR3,TLR7,TLR8識(shí)別障礙并且誘發(fā)抗體外轉(zhuǎn)錄RNA的免疫反應(yīng)。因此，為了增強(qiáng)和延長(zhǎng)mRNA的翻譯，高效液體色譜法純化的體外轉(zhuǎn)錄mRNA被用于清除dsRNA污染物，這樣可以減少type1IFN和炎癥前細(xì)胞因子的產(chǎn)生。

 二、RNA轉(zhuǎn)運(yùn)

 難以實(shí)現(xiàn)有效的RNA轉(zhuǎn)運(yùn)的問題已經(jīng)嚴(yán)重阻礙了RNA在藥物和疫苗的發(fā)展。為此，許多方法都試圖提高RNA的轉(zhuǎn)運(yùn)效率，主要包括優(yōu)化注射法，基因槍轉(zhuǎn)運(yùn)法，魚精蛋白濃縮法，RNA佐劑，多聚體和脂質(zhì)體納米粒子包裹RNA等方法。

 1、裸RNA

 最簡(jiǎn)單的應(yīng)用包括肌內(nèi)注射裸mRNA，最初在小鼠體內(nèi)導(dǎo)致報(bào)告基因的表達(dá)。后來用癌胚抗原（CEA）mRNA免疫小鼠使其產(chǎn)生抗癌胚抗原抗體的免疫反應(yīng)，讓裸RNA應(yīng)用可行性得以肯定。盡管在一系列動(dòng)物模型研究中都可以誘發(fā)產(chǎn)生抗體和T細(xì)胞免疫反應(yīng)，但因特異性RNA酶對(duì)RNA的迅速降解使這項(xiàng)技術(shù)應(yīng)用受限。許多用于提高轉(zhuǎn)運(yùn)效率的辦法都在實(shí)驗(yàn)中，包括應(yīng)用基因槍將RNA直接注入細(xì)胞質(zhì)中。由金粒子包裹的體外轉(zhuǎn)錄mRNA可以穿過細(xì)胞膜。在一個(gè)小鼠模型中用基因槍轉(zhuǎn)錄連接了EGFP（增強(qiáng)綠色熒光蛋白）的黑色素細(xì)胞自身抗原TRP2的mRNA誘導(dǎo)出了抗原特異性細(xì)胞和體液免疫反應(yīng)并且為機(jī)體對(duì)抗B16黑色素瘤肺部轉(zhuǎn)移灶提供了保護(hù)。另一種方法是魚精蛋白濃縮的mRNA，它可以保護(hù)RNA免于降解，并且通過MyD88,TLR7和TLR8依賴的信號(hào)通路誘導(dǎo)免疫反應(yīng)。濃縮魚精蛋白用于刺激產(chǎn)生抗原特異性的IgG抗體并激活特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞免疫反應(yīng)。然而，給轉(zhuǎn)移性黑色素瘤病人皮內(nèi)注射濃縮魚精蛋白mRNA在1/2的評(píng)價(jià)病人中是安全的并且提高直接免疫的T細(xì)胞的數(shù)量，而在1/7患有疾病的病人中有完全反應(yīng)。

 2、佐劑和共刺激分子

 在許多疫苗應(yīng)用中已經(jīng)證實(shí)添加佐劑實(shí)質(zhì)上可以增強(qiáng)免疫反應(yīng)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)裸mRNA自身就使一種佐劑因此它可以刺激免疫反應(yīng)。其他分子例如魚精蛋白，多聚體Ⅰ：CRNA和包含基序的CpG都有為mRNA類疫苗增強(qiáng)免疫反應(yīng)的效果。其他方法主要是將CD40L,CD70, OX40L, GITR和CD83共刺激分子序列整合在mRNA上來進(jìn)一步增強(qiáng)免疫反應(yīng)。

 3、包裹RNA和靶向樹突狀細(xì)胞（DCs）

 為了增強(qiáng)RNA的轉(zhuǎn)運(yùn)率和穩(wěn)定性，已經(jīng)評(píng)價(jià)了許多包裹RNA轉(zhuǎn)運(yùn)方案。在這種情況下，陽離子脂質(zhì)體如N-［1-（2，3二油氧基）丙醇］-N，N,N-三甲基氯化銨1（DOTAP）已經(jīng)被應(yīng)用于包裹RNA。納米顆粒已經(jīng)證實(shí)可保護(hù)mRNA免受核酶降解并可以增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)mRNA的攝取。近期已經(jīng)可以用pH依賴性多-（b-氨基酯）核心和磷脂殼制造出可完全降解的納米粒子。有效的納米粒子體內(nèi)mRNA轉(zhuǎn)運(yùn)已經(jīng)成功在動(dòng)物模型中誘導(dǎo)產(chǎn)生了強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)。例如，由DOTAP脂質(zhì)體包裹的OVA mRNA分子通過皮內(nèi)注射進(jìn)小鼠的耳廓保護(hù)其不受EG7-OVA細(xì)胞皮下腫瘤的侵害。潛在的粒子聚集導(dǎo)致的細(xì)胞內(nèi)外基因轉(zhuǎn)運(yùn)減少現(xiàn)象或許可以解釋為什么CTL（細(xì)胞毒性T細(xì)胞）對(duì)靜脈內(nèi)注射反應(yīng)比皮內(nèi)注射反應(yīng)更強(qiáng)烈。同時(shí)也證實(shí)了整合有融合基因特性的輔助脂質(zhì)體DOPE可以將CTL對(duì)DOTAP/DOPE包裹的mRNA的免疫反應(yīng)相較于DOTAP脂質(zhì)體包裹的mRNA的免疫反應(yīng)提高4倍。將OVA mRNA和GM-CSF mRNA共轉(zhuǎn)運(yùn)可以增強(qiáng)CTL的免疫反應(yīng)。相比之下，CD80和IL-2的協(xié)同刺激卻并沒有這種效果。另一個(gè)實(shí)驗(yàn)中選擇用組織化脂質(zhì)來運(yùn)送mRNA。通過組織化脂蛋白復(fù)合物系統(tǒng)性轉(zhuǎn)運(yùn)黑色素瘤相關(guān)抗原MART1的mRNA可以特異性保護(hù)機(jī)體不受B16F10黑色素瘤的侵害。其中組織化脂蛋白復(fù)合物是由聚乙二醇化的組化聚賴氨酸和L-組氨酸-乙酰胺組成的。增強(qiáng)性的抗B16免疫反應(yīng)是通過使用同時(shí)包含MART1和MART1-LAMP1的mRNAs獲得的。

 樹突狀細(xì)胞（DCs）是專門的抗原呈遞細(xì)胞，在刺激產(chǎn)生免疫反應(yīng)的過程中起著非常重要的作用。因此靶向樹突狀細(xì)胞為增強(qiáng)體內(nèi)免疫反應(yīng)提供了可能。然而早期研究證明，樹突狀細(xì)胞不能很好的被脂質(zhì)復(fù)合體轉(zhuǎn)染。因此納米顆粒就被用于增強(qiáng)靶向樹突狀細(xì)胞（DCs）的功能。說到腫瘤免疫，樹突狀細(xì)胞（DCs）可以被腫瘤相關(guān)抗原（TAAs）的mRNA或者整個(gè)腫瘤的RNA轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染了TAA mRNAs的樹突狀細(xì)胞（DCs）可以直接被用于研制疫苗而不需要利用病人特異的腫瘤細(xì)胞或抗原。這個(gè)方法的缺點(diǎn)一方面在于許多腫瘤缺乏特異性的TAAs另一方面在于并不是所有TAAs都可以誘導(dǎo)出有效的免疫反應(yīng)，故選擇特異性TAAs也是一個(gè)難題。許多有關(guān)TAA mRNAs的研究都誘導(dǎo)出了抗腫瘤免疫反應(yīng)。例如，轉(zhuǎn)染了前列腺特異性抗原（PSA）TAA mRNAs的樹突狀細(xì)胞（DCs）被用于治療前列腺癌病人，其誘導(dǎo)出了PSA特異性T細(xì)胞免疫反應(yīng)且大大降低了6/7病人體內(nèi)的PSA水平。并且用CEA mRNA 轉(zhuǎn)染的樹突狀細(xì)胞（DCs）誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)在胰腺癌病人中耐受良好，盡管只在1/4的病人體內(nèi)誘導(dǎo)出了抗腫瘤免疫反應(yīng)。另一個(gè)試驗(yàn)中，甘露糖組化脂質(zhì)復(fù)合體納米粒子被應(yīng)用于提高樹突狀細(xì)胞（DCs）中mRNA的轉(zhuǎn)染效果。靜脈注射mRNA裝載的人（11）-LPR100比無糖LPR100誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞表達(dá)EGFP效率高4倍。樹突狀細(xì)胞（DCs）轉(zhuǎn)染效果提高與抑制B16F10黑色素瘤的生長(zhǎng)和注射免疫M(jìn)ART1 mRNA裝載的人（11）-LPR100后病人生存期延長(zhǎng)現(xiàn)象都有關(guān)系。針對(duì)腦腫瘤，肺腫瘤，腎腫瘤和黑素色瘤等腫瘤，利用從病人體內(nèi)獲得的完整腫瘤RNA的方法已經(jīng)進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段。在這種情況下，在大約1/3參加試驗(yàn)的腦腫瘤和神經(jīng)母細(xì)胞瘤病人體內(nèi)中觀察到了臨床反應(yīng)。并且，在患有腎臟惡性腫瘤病人的試驗(yàn)中并未觀察到劑量相關(guān)的毒性反應(yīng)或自身免疫反應(yīng)。

 三、自體擴(kuò)增RNA

 單鏈RNA（ssRNA）病毒鑒于其可以自我復(fù)制的特性，被頻繁應(yīng)用于研發(fā)疫苗和腫瘤免疫治療。所有RNA病毒中，α病毒，黃病毒，重組病毒及麻疹病毒已經(jīng)作為RNA的轉(zhuǎn)運(yùn)和表達(dá)向量。下面簡(jiǎn)單介紹一下這些病毒。

 α病毒屬于包膜病毒，包含一條正鏈RNA基因組和包膜結(jié)構(gòu)。其中非結(jié)構(gòu)基因nsP1-4，專門負(fù)責(zé)高效RNA復(fù)制，可以讓RNA分子快速擴(kuò)增而使正鏈RNA可直接在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)翻譯。在體內(nèi)和體外試驗(yàn)中，復(fù)制率低的α病毒和復(fù)制率高的a病毒都被用于基因轉(zhuǎn)運(yùn)。并且這些病毒向量可以有多種形式的運(yùn)用，如重組病毒顆粒，裸RNA復(fù)制子或?qū)有蚏NA-DNA病毒矢量。同樣，有著單正鏈RNA基因組的黃病毒和α病毒以同樣的原理應(yīng)用于腫瘤免疫治療。相比之下，重組病毒和麻疹病毒是單負(fù)鏈RNA基因組，這使它們需要通過另一種方法來生成病毒矢量。但這并沒有限制它們?cè)谝呙缪邪l(fā)或免疫治療方面的應(yīng)用。自體擴(kuò)增RNA病毒矢量近來被廣泛應(yīng)用于感染性疾病和腫瘤疫苗的研制。例如，用重組庫金病毒（黃病毒屬）顆粒免疫多種動(dòng)物模型已經(jīng)證實(shí)對(duì)埃博拉病毒感染有保護(hù)作用。水泡性口炎病毒（VSV）（重組病毒屬）委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒（VEE）（α病毒屬）可以表達(dá)埃博拉病毒的糖蛋白。并且，水泡性口炎病毒的糖蛋白顆粒已經(jīng)進(jìn)入了Ⅰ/Ⅱ期臨床試驗(yàn)，這證實(shí)了它具有良好的安全性和埃博拉免疫原性。而用表達(dá)包膜蛋白域3（ED3）的麻疹病毒免疫的小鼠可以免受登革病毒的侵害。有趣的是，用miRNA序列的基因沉默方法已經(jīng)被用于VEE，顯示它可以在動(dòng)物模型中下調(diào)VEE的復(fù)制。在另一個(gè)研究中，作為VEE復(fù)制的關(guān)鍵的VEE RNA依賴性RNA多聚酶，在靶向針對(duì)它的5種miRNA中有3種可以成功抑制VEE在BHK細(xì)胞中的復(fù)制。許多與腫瘤免疫相關(guān)的研究都證實(shí)了自體擴(kuò)增RNA病毒可以誘發(fā)腫瘤退行性改變，延長(zhǎng)生存期甚至在幾種腫瘤的動(dòng)物模型中起到保護(hù)作用。例如，庫金病毒顆粒表達(dá)的GM-CSF使小鼠黑色素瘤模型發(fā)生了退行性改變。而表達(dá)PSCA（前列腺干細(xì)胞抗原）的VEE粒子在前列腺癌模型中表現(xiàn)出保護(hù)作用。在應(yīng)用了SFV介導(dǎo)轉(zhuǎn)運(yùn)的神經(jīng)特異性miR-124后在異種移植腦腫瘤的小鼠模型中得到了生存期延長(zhǎng)的結(jié)果。有趣的是，僅一次肌內(nèi)注射裸SFV-LacZ RNA就可以對(duì)患有CT26結(jié)腸癌的小鼠提供有效的保護(hù)。近期發(fā)現(xiàn)，用自體擴(kuò)增RNA向量免疫可以在注射部位早期誘導(dǎo)產(chǎn)生大量的1型IFN和IFN免疫反應(yīng)，這也許可以起到佐劑的效果或下調(diào)抗原表達(dá)。根據(jù)IFN受體敲除小鼠的研究，降低早期1型IFN反應(yīng)可以有效提高自體擴(kuò)增RNA向量的初始表達(dá)。另一個(gè)研究是與自體擴(kuò)增復(fù)制子RNA和納米科技結(jié)合相關(guān)的。用殼聚糖納米粒子包裹復(fù)制子RNA大大提高了向樹突狀細(xì)胞（DCs）轉(zhuǎn)運(yùn)的效率也增強(qiáng)了誘導(dǎo)體內(nèi)免疫反應(yīng)的效果。并且，為了避免引起宿主對(duì)自體擴(kuò)增RNA病毒的中間體dsRNA的免疫反應(yīng)，編碼保護(hù)病毒免疫入侵的蛋白E3,K3,B18的不可復(fù)制mRNA被一同轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入體內(nèi)。這個(gè)方法大大的抑制了蛋白激酶R和IFN通路的激活同時(shí)增強(qiáng)了自體擴(kuò)增RNA的表達(dá)和轉(zhuǎn)運(yùn)。而針對(duì)有轉(zhuǎn)移性去勢(shì)抵抗性前列腺癌的病人應(yīng)用由VEE顆粒介導(dǎo)表達(dá)的前列腺特異性膜抗原（PSMA）的Ⅰ期臨床試驗(yàn)已經(jīng)展開。在應(yīng)用劑量為0.9×107或者0.36×108IU的VEE-PSMA顆粒后沒有觀察到毒性反應(yīng)。盡管并沒有獲得PSMA特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)或臨床效果，但產(chǎn)生的中和性抗體表明在實(shí)驗(yàn)中運(yùn)用的劑量是可選的。關(guān)于將脂質(zhì)體包裹的表達(dá)IL-2的SFV粒子應(yīng)用于黑色素瘤和腎癌的病人的研究也進(jìn)入了Ⅰ期臨床試驗(yàn)。靜脈注射使IL-2在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的水平提高了5-10倍，并可以持續(xù)5天。有了包裹的過程，SFV顆粒不能被宿主免疫系統(tǒng)識(shí)別，使病人可以反復(fù)接受注射。最大耐受計(jì)量被定為每平方米3×109個(gè)顆粒。

 RNA藥物升級(jí)

 許多RNA類藥物已經(jīng)進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段。其中很大一部分是基于siRNA直接注射，脂質(zhì)納米顆粒和包裹病毒顆粒的轉(zhuǎn)運(yùn)方法。在這種情況下，在34個(gè)患有晚期實(shí)體腫瘤的病人身上進(jìn)行了針對(duì)蛋白激酶N3的脂質(zhì)體包裹siRNA的Ⅰ期臨床試驗(yàn)。以10為單位的遞增梯度劑量通過靜脈注射進(jìn)入病人體內(nèi)同時(shí)用CT或MRI監(jiān)測(cè)他們的反應(yīng)。這種siRNA轉(zhuǎn)運(yùn)有很好的耐受性而且僅引起了很低的毒性反應(yīng)。41%的病人病情都比較穩(wěn)定，其中8個(gè)病人在病情穩(wěn)定的基礎(chǔ)上表現(xiàn)出部分或完全的轉(zhuǎn)移灶退行改變。而且，針對(duì)心血管疾病和罕見肝病的Ⅰ期臨床試驗(yàn)也獲得了進(jìn)展。目前，在慢性HBV感染者中針對(duì)通過脂質(zhì)納米顆粒轉(zhuǎn)運(yùn)的乙型肝炎病毒（HBV）的RNAi的Ⅱ期臨床試驗(yàn)也取得了進(jìn)展。利用針對(duì)半胱天冬酶2 mRNA的siRNAs來治療非動(dòng)脈性早期缺血性視神經(jīng)通路疾病也進(jìn)入了Ⅲ期臨床試驗(yàn)。人們也致力于尋找針對(duì)肺癌的RNA類精準(zhǔn)藥物，也包括長(zhǎng)效或短效用于診斷和治療的非編碼RNAs。生物標(biāo)記物的臨床試驗(yàn)可以為治療肺癌提供更好的方法。Moderna 有許多針對(duì)流感病毒，寨卡病毒和企昆貢亞病毒等感染性疾病的mRNA類藥物都在進(jìn)行臨床試驗(yàn)（主要是Ⅰ期臨床試驗(yàn)）。

 RNA疫苗的進(jìn)展

 RNA類疫苗最新的進(jìn)展主要集中在脂質(zhì)納米顆粒包裹的RNA和自體擴(kuò)增RNA病毒向量應(yīng)用的方面。例如，核苷改造的寨卡病毒 prM和E糖蛋白R(shí)NA分子已經(jīng)應(yīng)用脂質(zhì)納米顆粒來包裹。單支低劑量皮下注射即可在小鼠及其它非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生強(qiáng)烈而持久的中和性抗體。在小鼠和非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物體內(nèi)誘導(dǎo)寨卡病毒保護(hù)性抗體的劑量分別是30微克和50微克。自體擴(kuò)增RNA向量如昆金病毒和VEE也保護(hù)了注射致命病毒劑量的豚鼠不受埃博拉病毒的感染。同樣，用能表達(dá)人猿免疫缺陷病毒gag-pol的昆金病毒顆粒免疫的小鼠可以免受人猿免疫缺陷病毒的侵害。至于RNA藥物，通過確定腫瘤病人體內(nèi)個(gè)體特異性腫瘤突變來生產(chǎn)的分子優(yōu)化疫苗取得了巨大進(jìn)步。在這種情況下，靈活的個(gè)體化腫瘤疫苗已經(jīng)進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段。在結(jié)內(nèi)應(yīng)用合成RNA疫苗的基礎(chǔ)上，由RNA脂質(zhì)復(fù)合體納米顆粒改造的第二代RNA疫苗已經(jīng)進(jìn)入臨床試驗(yàn)。例如，RNA脂質(zhì)復(fù)合體納米顆粒（lipoMERIT）編碼的侵襲性黑色素瘤共有腫瘤抗原免疫療法已經(jīng)在進(jìn)行臨床Ⅰ/Ⅱ期試驗(yàn)的檢測(cè)。正在進(jìn)行研究的預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)顯示在40多個(gè)病人身上都獲得了良好的安全性和耐受性。疫苗誘導(dǎo)免疫反應(yīng)陽性率很高而且多次注射Lipo-MERIT可以反復(fù)誘導(dǎo)產(chǎn)生抗原特異性免疫反應(yīng)同時(shí)增強(qiáng)免疫前狀態(tài)。

 結(jié)語和展望

 RNA類生物藥物和疫苗在藥物界是一個(gè)相對(duì)比較前沿的技術(shù)。但是，它們的應(yīng)用范圍極廣，包括在糖尿病，腫瘤，結(jié)核，心血管疾病和感染性疾病等疾病預(yù)防性和治療性的應(yīng)用方面的潛能。盡管700多種RNA和DNA治療性藥物中大部分都處于臨床前期研發(fā)階段，只有小部分進(jìn)入了臨床試驗(yàn)，但據(jù)估測(cè)在2020年它將會(huì)占據(jù)12億市值。全球目前有160家公司和65家科研團(tuán)隊(duì)涉獵RNA分子類的治療方案。迄今為止至少有12種mRNA疫苗正在研發(fā)。并且相較于DNA類藥物，RNA藥物更具潛力。特別是之前研制的寡核苷酸類藥物，對(duì)RNA病毒和mRNA基礎(chǔ)上研制的藥物和疫苗會(huì)大有助益。如今，對(duì)RNA類藥物和疫苗來說，有關(guān)于毒性和藥物轉(zhuǎn)運(yùn)的問題仍亟待解決，但近期通過RNA分子包裹和自體擴(kuò)增RNA病毒的應(yīng)用增強(qiáng)了RNA穩(wěn)定性并解決了轉(zhuǎn)運(yùn)問題，讓這類藥物在未來藥物發(fā)展成為可能。

 本文分享自生物制品圈《RNA類藥物以及疫苗的研究進(jìn)展》